Una nuova generazione di macchine per l’ordinamento in sequenze del DNA apre nuovi scenari nel campo della ricerca genomica. Con queste tecnologie avanzate, i ricercatori hanno già svelato differenze significative tra l’uomo moderno e i cugini neandertaliani e hanno messo a punto test più accurati per la diagnosi del cancro.
di Jon Cohen
Il 6 febbraio del 2007 i dirigenti di 454 Life Sciences hanno mostrato al 78enne James Watson un primo abbozzo del suo genoma. L’avvenimento ha assunto un alto valore simbolico, con risvolti di ordine poetico. 45 anni fa, Watson ha vinto il premio Nobel per aver contribuito alla scoperta della struttura a doppia elica del DNA; è stato anche uno dei primi animatori del Progetto Genoma Umano, che ha permesso nel 2003 di ottenere una copia del codice a spirale, con un costo di 3 miliardi di dollari in 13 anni. Ora 454 si è spinta oltre questo megaprogetto, che ha messo insieme il DNA di molte persone per determinare la sequenza genetica che costituisce il modello umano. L’azienda, grazie alla sua macchina d’avanguardia per l’ordinamento in sequenze, ha letto un singolo codice genetico, quello della persona che ha offerto il contributo più significativo per raggiungere questo risultato.
Ma Jonathan Rothberg, che ha fondato 454 a Branford, nel Connecticut, con l’idea di produrre una macchina per il sequenziamento più efficiente di quelle utilizzate dal Progetto Genoma Umano, non fa riferimento né al simbolismo, né alla poesia, quando racconta del suo incontro con Watson. Invece, parla di costi, di velocità e di un futuro in cui chiunque potrà conservare il proprio genoma personale su disco: uno scenario sempre più plausibile. Abbiamo speso 200.000 dollari per le sequenze del genoma di Watson, spiega Rothberg. E abbiamo lavorato soprattutto a dicembre e gennaio.
Rothberg, che ora presiede il consiglio d’amministrazione di 454, sottolinea che il Progetto Jim rimane un lavoro in continua evoluzione, che richiederà altro tempo e denaro. Da febbraio, l’azienda ha ordinato in sequenze il DNA di Watson solo tre volte (ogni volta aumentando il livello di accuratezza e riempiendo i vuoti); nove passaggi sono stati necessari per arrivare alla copia finale del Progetto Genoma Umano.
454 di Rothberg è solo una delle tante aziende, tra cui Illumina di San Diego e Applied Biosystems di Foster City (si veda la tabella Altri sequenziatori d’avanguardia a pag. xx), che sta sviluppando macchine per la decodificazione sempre più rapida del DNA. E così come il costo dei computer più potenti è precipitato con il costante incremento dei transistor su chip, allo stesso modo il prezzo del sequenziamento del DNA è in discesa libera con l’avvento di queste macchine. Oggi, il costo di un genoma umano decodificato con i sequenziatori usati per il Progetto Genoma Umano oscillerebbe tra i 25 e i 50 milioni di dollari. Con le nuove generazioni di macchine ora disponibili si è scesi a 1 milione di dollari e per il 2008 si potrebbe arrivare a 100.000 dollari.
Come ha mostrato la storia dell’informatica, una maggiore potenza di elaborazione unita a costi più bassi può aprire la strada ad applicazioni prima iimmaginabili. Sulla scia del Progetto Genoma Umano i ricercatori si sono trovati a fronteggiare difficili decisioni economiche su quali fosse il prossimo genoma da sequenziare: scimpanzé o macaco, mucca o delfino, riso o manioca. Le nuove macchine consentono di ordinare in sequenze qualsiasi cosa abbia un qualche valore. Inoltre, più informazioni sulle sequenze affluiscono alle banche dati, più nascono nuove aree di ricerca. Gli scienziati possiedono ora una capacità mai vista prima di fare confronti tra specie diverse e di fare chiarezza su tutte le questioni più importanti: dai problemi evolutivi alle ragioni genetiche delle differenze individuali nelle predisposizioni e nelle resistenze alle malattie. La ricerca effettuata con le macchine di 454 Life Sciences e pubblicata sulle riviste specialistiche include il sequenziamento parziale del genoma dell’uomo di Neandertal e lo sviluppo di nuovi test per le mutazioni genetiche causate dal cancro, una tecnologia quest’ultima che potrebbe aiutare i medici a personalizzare le terapie per i loro pazienti.
L’anno scorso è stato il periodo più esaltante nella storia della genomica dai giorni del Progetto Genoma Umano, afferma Eric Lander, primo autore della pubblicazione della stesura iniziale del genoma umano del progetto e ora responsabile del Broad Institute per la medicina genomica, a Cambridge, nel Massachusetts. Il sequenziamento sta diventando economico ed efficace al punto da poterlo applicare a qualsiasi problema. È il massimo. Francis Collins, direttore del Progetto Genoma Umano per i NIH (National Institutes of Health) prevede che le nuove tecnologie di sequenziamento avranno profonde conseguenze sul futuro della ricerca biomedica e, più in generale, sulla stessa medicina.
Una soluzione assolutamente originale
L’ufficio di Jonathan Rothberg ricorda da vicino un bar-tavola calda, con un pavimento a piastrelle rosse e nere, sedie cromate similpelle rossa Naugahyde e un divano con braccioli simile al retro di una Cadillac del 1959, con enormi pinne posteriori e fanalini a forma di proiettile. Invece della scrivania, ci si trova dinanzi a un piano bar con gli immancabili sgabelli. Una serie di bottiglie di vino prodotte in un vigneto di sua proprietà, nel Connecticut, riempiono alcuni scaffali. Oltre le finestre si staglia il Long Island Sound. Tutto l’ambiente lascia intravedere un temperamento originale e Rothberg non tradisce questa impressione. Nel 1991, mentre stava completando il suo dottorato in biologia alla Yale University, Rothberg ha creato CuraGen, una delle prime aziende a sviluppare farmaci su base genomica. Oltre a CuraGen e 454 Life Sciences, egli ha dato vita a un istituto per lo studio delle malattie infantili e anche a un’altra azienda di biotecnologie, RainDance Technologies, che ha prodotto quelli che egli definisce schede di circuito liquido, utilizzate per migliorare il livello degli esperimenti manipolando modeste quantità di fluido. E tutto ciò a soli 43 anni.
In effetti, è stato l’interesse nei confronti della unicità dell’individuo che lo ha portato a progettare un sequenziatore che nelle sue intenzioni renderà i controlli del genoma un’operazione di routine come sono ora gli esami del sangue. Rothberg ha in mano il cuore della macchina di 454 Life Sciences, un vetrino con 1 milione e 600 mila pozzi in miniatura, ognuno largo approssimativamente 50 micrometri (circa la metà della grandezza di un capello umano) e profondo 55 micrometri. Questo chip permette alla macchina di ordinare in sequenze il DNA così rapidamente, perché una reazione chimica distinta si può compiere in ogni pozzo.
Il sequenziamento genico si avvantaggia del fatto che i filamenti dell’elica del DNA sono complementari: delle 4 basi chimiche ” adenina, guanina, timina, citosina ” che sono legate insieme in ordini diversi in ogni filamento, l’adenina si accoppia solo con la timina e la guanina solo con la citosina. Nella tecnica di sequenziamento usata più comunemente, che si affida a uno schema sviluppato 30 anni fa da Frederick Sanger dell’Università di Cambridge, i frammenti di DNA sono suddivisi in singoli filamenti ed esposti ai nucleotidi liberi, che si legano alla originale As, Cs, Ts e Gs per generare nuovi filamenti complementari. Questi filamenti variano in lunghezza perché alcuni nucleotidi liberi sono stati modificati per impedire alla reazione di andare avanti; quando una di queste basi si unisce al suo obiettivo, la catena smette di crescere. Ognuno di questi quattro tipi di terminatore di catena ha legato un differente fluoroforo che diventa fluorescente se colpito da un raggio laser. Una corrente elettrica separa i filamenti per dimensioni e il laser legge i colori per determinare quale è l’ultima base aggiunta a ogni catena, decifrando la sequenza. La grande maggioranza dei laboratori attuali che fanno il sequenziamento impiegano una macchina prodotta da Applied Biosystem che decifra due milioni di basi al giorno.
L’ultimo sequenziatore di 454 arriva a leggerne 300 milioni al giorno.
Il metodo di 454 permette di saltare alcuni dei passaggi più complessi, in ordine di tempo, del tradizionale ordinamento in sequenze, come la separazione dei filamenti per dimensioni. A differenza del sequenziatore di Sanger, non prende in esame i terminatori di catena, ma registra le basi che si aggiungono al filamento in crescita. All’inizio, una molecola di DNA è casualmente suddivisa in più tratti. Poi i diversi frammenti vengono inseriti nei singoli filamenti, ognuno dei quali si unisce a una minuscola pallina. Un processo biochimico copia i singoli filamenti, in modo tale che 10 milioni di cloni sporgano da ogni pallina; queste palline, una per una, vengono quindi deposte nei diversi pozzi (1 milione e 600 mila). As, Cs, Ts e Gs fuoriescono dai pozzi in modo sequenziale per sintetizzare nuovi filamenti complementari.
A questo punto interviene il meccanismo realmente innovativo: usando un metodo descritto per primo da Pål Nyrén e i suoi collaboratori al Royal Institute of Technology, in Svezia, il sequenziatore di 454 registra immediatamente il momento in cui una base si aggiunge a un filamento, sfruttando il fatto che la reazione legante rilascia una sostanza chimica chiamata pirofosfato. Nei pozzi della macchina di 454, il pirofosfato viene catturato da una cascata chimica che finisce per colpire l’enzima luciferasi (che si trova allo stato naturale nelle lucciole), emettendo una scarica luminosa. Un normale dispositivo ad accoppiamento di carica come quelli usati nelle macchine fotografiche digitali e nei telescopi rileva ogni flash, leggendo le sequenze di As, Cs, Ts e Gs in ogni frammento. Il processo permette di decifrare dalle 200 alle 300 basi di fila. Come nel sequenziamento tradizionale, i computer cercano di mettere insieme le sequenze alla estremità di un frammento e all’inizio di un altro, riunendo i frammenti nel giusto ordine.
Il sequenziatore che 454 ha commercializzato verso la fine di ottobre 2005 aveva comunque qualche serio limite. Poteva leggere solo 100 basi di fila (più lunga è la serie di basi in ogni frammento della sequenza, più semplice risulta assemblare un intero genoma), e aveva anche difficoltà a fornire una mappa accurata dei tratti ripetitivi, per esempio sei As consecutive. Ma, sostiene Rothberg, la filosofia di 454 era: Prima fai, meglio è. L’azienda scelse chi avrebbe adottato la novità (i cosiddetti early adopter), tra cui Lander del Broad Institute, con la speranza che qualcuno di loro pubblicasse scoperte legate al sequenziatore. Si devono selezionare le persone giuste all’inizio, ma gli altri, quelli che seguono l’evolversi della vicenda, sono il sale del mercato, sostiene Rothberg. E sono loro a leggere i documenti che sono stati valutati da specialisti tramite il sistema della peer review.
I neandertaliani
Un documento di un early adopter che ha ricevuto una considerevole attenzione da parte di scienziati e pubblico allo stesso modo è stato uno studio del DNA dell’uomo di Neandertal condotto da Svante Pääbo del Max Planck Institute per l’Antropologia evolutiva, a Leipzig, in Germania. Gli uomini di Neanderthal, le specie più vicine ai moderni esseri umani, sono scomparsi circa 30.000 anni fa, e più ipotesi che fatti circondano la loro relazione genetica con noi. Anche se Pääbo aveva condotto una serie di precedenti ricerche sul DNA dell’uomo di Neandertal, non era riuscito ad andare oltre un’analisi rudimentale a causa degli alti costi e delle difficoltà intervenute. Il problema è che nel corso di migliaia d’anni, i pochi campioni conosciuti di DNA neandertaliano provenienti dai fossili sono degradati a piccoli frammenti di circa 50-75 paia di basi. Inoltre, il DNA è spesso contaminato da materiale genetico di microrganismi e delle persone che hanno maneggiato i fossili. Comunque Rothberg ritiene che la macchina di 454 possa analizzare a bassi costi una serie di brevi sequenze, ricavando dati sufficienti a ottenere informazioni preziose da un materiale così degradato. Rothberg si è messo in contatto con Pääbo, che ha accettato di collaborare.
Dopo aver ordinato in sequenze geni di 70 ossa di Neandertal e di campioni di denti, il gruppo di Pääbo e i ricercatori di 454 hanno scoperto un campione, risalente a 38.000 anni fa, che aveva gran parte del DNA leggibile. Come hanno riferito in un articolo apparso lo scorso autunno su Nature, gli studiosi hanno sequenziato un milione di paia di basi da meno di 200 milligrammi di materiale, un’impresa che ha consentito di acquisire indizi sui possibili incroci tra i moderni umani e gli uomini di Neandertal e le differenze tra le due diverse specie. Ancora più importante, l’articolo dimostra che è possibile sequenziare tutti e tre i miliardi di basi che formano il genoma di Neandertal. Decifrarlo interamente aiuterebbe a risolvere una serie di misteri, in particolare chiarire se l’uomo di Neandertal avesse la capacità genetica di parlare.
Capire se i moderni umani e i neandertaliani si sono incrociati o abbiano avuto la possibilità di parlarsi tra loro ha indubbiamente un grosso valore mediatico, ma altre applicazioni del sequenziamento ultrarapido del DNA potrebbero avere un impatto di gran lunga maggiore sulla medicina e sulla nostra vita. Il metodo tradizionale di ordinamento in sequenza guarda al DNA di molte cellule differenti. Ma se una di queste cellule è, per esempio, cancerosa, la sua sequenza può differire leggermente da quella delle cellule sane. In questi casi, il computer seleziona le sequenze che ricorrono più frequentemente e scarta le altre. Invece, i sequenziatori di prossima generazione, come quelli commercializzati da 454, clonano e ordinano in sequenze singole molecole di DNA, permettendo analisi di una tale accuratezza da portare alla luce varianti rare (anche i normali sequenziatori possono esaminare singole molecole, ma a costi proibitivi). Le implicazioni del sequenziamento monomolecolare sono enormi per la medicina. Mentre prima, con l’ordinamento in sequenze tradizionale, non era pensabile di riscontrare le differenze tra cellule sane e malate, ora le nuove macchine possono portare avanti facilmente questo tipo di esperimenti.
Matthew Meyerson, un patologo clinico del Dana-Farber Cancer Institute, a Boston, ha pubblicato una ricerca che mostra come la macchina di 454 possa contribuire a scoprire le mutazioni legate al cancro al polmone. I farmaci per il cancro il polmone al momento disponibili hanno come obiettivo il gene che Meyerson sta sequenziando, e il patologo spera che i medici sapranno fare le scelte giuste sulle persone a cui somministrare i farmaci, sapendo che un determinato paziente ha una particolare mutazione. Mi immagino che in pochi anni tutti i pazienti affetti da cancro avranno la loro patologia accuratamente definita con il sequenziamento monomolecolare, se la tecnologia continuerà a diminuire i suoi costi, dice Meyerson.
In una variante su questo tema, Michael Kozal, un medico clinico esperto di AIDS, a Yale, ha collaborato con 454 per fare il sequenziamento particolareggiato dell’HIV per determinare la presenza di piccole popolazioni di virus resistenti al farmaco. I primi test della tecnica sperimentale su pazienti hanno rilevato il doppio di HIV resistente rispetto al sequenziamento effettuato da Sanger. Questa informazione potrebbe consentire ai medici di personalizzare i regimi terapeutici, aumentando l’efficacia dei costi. Con il nostro sistema è un’operazione semplice, sostiene Michael Egholm, il responsabile scientifico di 454 che sta collaborando con Kozal. Prima non si poteva neanche provare a farlo.
Il Progetto Genoma Personalizzato
George Church, un pioniere dell’ordinamento in sequenze alla Harvard Medical School, afferma che la chiave sta nei costi. A suo parere, con la progressiva caduta dei loro prezzi nei prossimi anni, queste macchine diventeranno una forza che spinge in senso democratico, rendendo obsoleti i sequenziatori tradizionali, allo stesso modo in cui i personal computer hanno sostituito i mainframe. Questo passaggio darà vita a una serie di applicazioni al momento imprevedibili. Se stessimo ancora lavorando con i computer di grosse dimensioni, parecchie innovazioni non avrebbero visto la luce, egli spiega.
Church, che faceva parte del gruppo di una decina di ricercatori che ha promosso il Progetto Genoma Umano a metà degli anni 1980, è uno dei pochi biologi che ha tra la sua apparecchiatura di laboratorio un morsetto e un trapano a colonna, che usa per costruire i suoi sequenziatori di prossima generazione; al momento ne ha già completati otto (si veda TR35, settembre/ottobre 2006). Convinto che le aziende si facciano pagare troppo le loro macchine, Church è ben lieto di condividere il suo know-how con i colleghi interessati. A suo dire, la sua filosofia si avvicina a quella di wiki (un sito web che presenta una collezione di documenti ipertestuali sempre in aggiornamento) e di Linux, perché se un gruppo di formiche si mette insieme, riesce a spostare un albero della gomma.
Il grande progetto di Church è di incanalare il flusso a buon mercato di As, Cs, Ts e Gs in quello che egli chiama Personal Genome Project (Progetto di Genomica Personalizzata). Nel Progetto Genoma Umano i ricercatori hanno utilizzato il DNA di diverse persone, ognuna delle quali, per ragioni private, rimane anonima. Pertanto, la sequenza finale rappresenta una persona composita con un conglomerato di diversi bagagli genetici e storie mediche. Church vuole che il suo Progetto di Genomica Personalizzata decifri il DNA di persone che offrono spontaneamente le loro cartelle cliniche. Egli pubblicherà tutti i risultati su Internet. Con il tempo, prevede Church, milioni di persone si uniranno al progetto, mettendo on line sequenze, cartelle cliniche e, se vogliono, anche le loro fotografie. Il mondo intero avrà quindi accesso a tutti i dati necessari per valutare liberamente le diverse teorie.
Anche se Church ha ricevuto considerevoli finanziamenti dai National Institutes of Health per sviluppare la tecnologia per l’ordinamento in sequenze, le questioni etiche, legali e sociali sollevate dal Progetto di Genoma Personalizzato hanno impedito ai NIH di sostenerlo, malgrado una relazione positiva per una richiesta di finanziamento ad agosto del 2005. Appena ho ricevuto l’approvazione, i NIH sembravano in gran fermento e probabilmente non per l’entusiasmo, egli racconta. Church ha provato ad affrontare i problemi di privacy e riservatezza, facendo notare che non c’è alcun obbligo di rendere pubblica l’identità e che i NIH hanno già finanziato progetti di genetica umana che offrono scarse garanzie su questi argomenti.
Church riconosce che la conoscenza particolareggiata del proprio DNA potrebbe creare problemi a diverse persone. Non si permette ai propri figli di visitare i siti pornografici su Internet, egli dice, e si tralascia di curiosare i siti più violenti o più volgari. La sua speranza è che invece di ruotare intorno al nodo dell’accesso al genoma grezzo, le persone si facciano aiutare da esperti a interpretare l’informazione.
Malgrado la mancanza di finanziamenti federali e le obiezioni di tipo etico, Church sta andando avanti, sicuro che i progressi nella tecnologia del sequenziamento sosterranno l’idea del Progetto Genoma Personalizzato, così come i progressi informatici hanno permesso a utenti che non si conoscevano di condividere dati in modi che nessuno avrebbe mai pensato al tempo del debutto, 30 anni fa, dei due drive per floppy disk di Apple II. Con macchine per l’ordinamento in sequenze sempre più efficienti, conclude Church, e i costi in continua discesa, la genomica personale si affermerà a livelli ora impensabili.
Una vincita alla lotteria
A ottobre 2006, la X Prize Foundation ha annunciato un premio di 10 milioni di dollari per chi avrebbe prodotto sequenze estremamente accurate di 100 genomi umani in 10 giorni o meno senza spendere più di 10.000 dollari per genoma. Una delle prime partecipanti è stata 454, che prevede la produzione di palline ancora più brevi per permettere alla macchina di leggere ancora più DNA a ogni passaggio all’incirca allo stesso costo. Non abbiamo bisogno di nuovi accorgimenti fisici o matematici per produrre un genoma da 1.000 dollari, sostiene Rothberg.
Lasciando da parte la questione di quando, o se, qualcuno si aggiudicherà l’X Prize, il sequenziamento del DNA continuerà sicuramente a scendere di prezzo e a salire in accuratezza. Fino all’altro anno, il sequenziamento non è riuscito a imporre il proprio marchio sulla prossima era genomica, come è nelle sue possibilità, afferma David Bentley, responsabile scientifico di Illumina. In realtà, il prezzo del tradizionale ordinamento in sequenze non è sceso abbastanza rapidamente. Ora nel settore si riscontra molto più ottimismo di prima, dice Bentley. Il sequenziamento di prossima generazione ha un ruolo enorme da giocare.
Ascoltare uno scienziato che elenca le diverse possibilità future è come trovarsi di fronte al vincitore di una lotteria. La medicina personalizzata come i test e le terapie per il cancro che Meyerson, di Dana-Farber, spera di introdurre sono ancora al punto di partenza. Bentley ritiene che i nuovi sequenziatori apriranno squarci sulle vaste regioni non codificate del genoma che attivano e disattivano i geni. Egholm di 454 fa notare che, in effetti, il Progetto Genoma Umano non ha ordinato in sequenze tutto il DNA umano; ci potrebbero essere geni ancora ignoti che letture più accurate possono scovare. Lander del Broad Institute prevede un flusso di nuove informazioni su ciò che porta una cellula a differenziarsi in un tipo o in un altro (un mistero importante della biologia evolutiva) e su cosa controlla i diversi stati cellulari. Mi sono reso conto che è più difficile spiegare il cancro che curarlo, egli spiega, ma è un passaggio fondamentale, perché porterebbe vantaggi per la cura di tutte le altre malattie.
Entro il prossimo anno, prevede Lander, gli scienziati saranno in grado di condurre ricerche che generano terabasi di informazioni, un trilione di As, Cs, Ts e Gs. Non avrei neanche pronunciato la parola terabase fino allo scorso anno, conclude Lander. E se tutti questi dati saranno liberamente disponibili sul Web, si farà strada un tipo di biologia completamente differente.
